anne_blackwell
雷竞技raybet仔细的和一致的样品制备肽图数据质量的第一步。
蛋白质消化肽映射中最复杂的样本准备要做当监测其关键质量属性——也许只有样品多糖分析的准备工作。雷竞技raybet安捷伦科技公司的肽图“如何”指南展示了一个通用的协议,但总有蛋白质或矩阵,需要特殊考虑。有多个步骤,选择和优化的机会。把一些想法在你的样品准备过程会有很大的差异在肽的分离和检测。我询问了几个同事(谢谢,苏雷什,维罗妮卡,和丽塔!),和基于我们的集体经验我们提出这些建议。
样品制备
一些矩阵需要清理或调整更有效的消化。一个亲和捕获步骤可以用来消耗矩阵蛋白质如白蛋白、免疫球蛋白或丰富目标蛋白质磷酸化和糖基化等基于多功能天车。
- 考虑你的整个工作流程在早期——如果你计划使用MS检测,仔细思考你所使用的试剂和你使用多少。他们是多么简单删除从样本清理步骤?他们会导致离子抑制吗?
- 考虑一个空白样品通过你的整个过程作为故障诊断目的的控制(通过任何浓缩样品准备和清理)。
- pH值可以是一个平衡——低pH值可以帮助防止脱酰氨基作用,但许多蛋白酶工作更有效地在略微升高博士(你不讨厌选择两害取其轻吗?)
变性、减少和烷基化
有效的蛋白酶乳沟网站的访问,其必要变性蛋白质,减少和二硫化烷基化物的债券(当然,除非你想地图二硫键)。
- 如果你使用尿素变性,不要加热样品!这将导致赖氨酸carbamylation,我们(通常)不想添加任何天车。
- 胍可以抑制蛋白酶活性,所以一定要稀释消化之前或删除它。
- 高度集中或复杂的蛋白质可以在变性步骤容易沉淀,所以呢,要注意。稀释在变性前可能会有所帮助。
- 德勤和巯基乙醇是很臭的还原剂。TCEP德勤一样有效,它是无味的(在我的书一个足够好的理由!)。只是当心不是特别稳定在磷酸缓冲中性pH值,所以一个新的解决方案是必要的。
消化
胰蛋白酶是最常用的蛋白酶,因为它的分裂是如此定义良好和可预测的,但也有各种各样的消化剂可用如果胰蛋白酶的赖氨酸和精氨酸分裂不产生合适的肽的分离和检测。我们会进一步讨论这个在以后的帖子。选择的最佳pH值依赖于消化试剂,但消化时间,温度,蛋白酶浓度是彼此独立的变量以及靶蛋白和蛋白酶。
- 胰蛋白酶乳沟是慢当赖氨酸或Arg毗邻半胱氨酸,Glu,或Asp,并不发生在所有层或参数时Pro紧随其后。1
- 两个独立的胰蛋白酶可能有助于增加实现完整的消化。
- 消化后,与0.1%甲酸酸化样品,而不是1%。
- 许多协议禁止某些孵化或反应时间,但如果你实现一个使用长期协议,这将是值得一个实验看到这一步真的需要多长时间。许多研究生(包括我)都让反应12小时,因为他们想回家过夜!
- 胰蛋白酶(或其他蛋白酶)自我分解可能会导致额外的山峰在肽地图。一些胰蛋白酶产品更容易比别人。只是一些在你的脑海中如果你故障排除coelution或者追逐身份不明的山峰(空白控制可以帮助)。
胰蛋白酶是如此普遍,协议是丰富的,但当我们的话题,我想说这自然的协议本文由Giansanti等其他六个协议细节消化蛋白酶一起讨论各自的利弊。1
浓缩和清理
如果你正在寻找特定的天车如磷酸化、糖基化、浓缩后消化可能会有帮助。清理往往是必要的成功你的肽图分析,特别是与MS检测盐电离,因此灵敏度可以极大地限制。
- 淡化样品之前女士最佳灵敏度分析。盐可以大大限制样品电离。
- 如果样品出现不透明或多云,过滤器之前注入。
最后一个通用技巧——一旦你已经选定了一个协议,坚持下去!协议的任何变化会导致不一致的结果和更多的问题。
说话很快,
安妮
引用
- Giansanti, l . Tsiatsiani T.Y.低,A.J.R.见鬼。六个替代蛋白酶质量spectrometry-based胰蛋白酶之外的蛋白质组学。自然的协议,2016年。
关键词:生物列,液相色谱,提示和技巧,肽图,样品准备,AdvanceBio博客
