第三部分故障排除序列覆盖-肽映射

我们用来评估指标之一肽序列覆盖地图。有时候我们真的只对几个关键肽感兴趣,但其他时候,重要的是要看到整个蛋白质序列。所以我们能做什么当我们没有100%的序列覆盖率?

第一步是检查你的数据和你的蛋白质的序列的多少理论肽序列是失踪,没有检测到。

下面第一个例子中,丢失的碎片单个氨基酸,或非常小的di - tri-peptides吗?例如,连续序列含有赖氨酸残留吗?反相色谱法通常用于肽图不会保留这些物种。

曲妥珠单抗的肽图每个链序列覆盖率为98.49%。灰色的突显出氨基酸的部分没有检测到。一个二肽(香港)丢失的光链,而两个二肽(AK和SR)和一个四肽(GQPR)重链的缺失。

在这种情况下有三种可能的下一个步骤:

• 如果这些残留物是微不足道的,我们可以推进现有的数据和肽映射方法。
• 如果它是检测的关键氨基酸,有两种可能性:
  • 选择不同的消化酵素产生不同的乳沟网站。胰蛋白酶通常是首选蛋白酶的可预测性,但还有很多其他的选择。
  • 改变消化协议,目的是产生一个不完整的消化,例如,通过缩短消化时间。

有一点需要注意,是小,亲水性肽没有发现?并不是所有的C18柱都是一样的,有些人会比其他人更保留。不同的C18柱可能是答案。

失踪的肽非常大或疏水吗?例如,曲妥珠单抗的轻、重链互补决定区包括一个非常长,疏水肽可以挑战来检测。

在这种情况下,如何恢复这些肽取决于肽在哪里迷路。

• 肽可以坚持任何表面接触,包括吸管技巧、样品存储管,或autosampler瓶。切换供应商或材料可能会有所帮助。
• 重新审视你的样品准备协议——一个特别疏水肽可以沉淀?记住,乙腈的崩溃是一个简单,因此流行方式沉淀蛋白的解决方案。
• 如果肽坚持列,有几件事想:
  • 你能去一个更高的百分比有机流动相?或添加一个更强的有机溶剂如异丙醇(可能)乙腈移动阶段?有一个这样的例子所示。
  • 转换的列化学可能的解决方案——再一次,下次。
• 最后,无关的肽可能被卡住了,回到序列一次。是有缺失的分裂?调整消化协议或不同的蛋白酶可能是有益的。(或者更简单,你允许错过了分裂,当你搜索数据?也许答案是一样简单的复选框!)

这马伯肽地图只有约75%的序列覆盖率——绝对是个问题。看着下面的序列,我们可以看到,有一些非常大的肽失踪。一个失踪的肽的轻链长42残留物,重链,另一个失踪的63氨基酸!胰蛋白酶的肽平均只有6残留¹和方法一般是相应的开发。在这种情况下,梯度没有去足够高的有机——只有19%的乙腈。

是几乎不可能的目录每一个原因失踪的肽。有时一步恢复缺失肽引起另一个丢失,需要一个像结合酶消化方法。今天我们真的专注于消化和色谱方法调整,尽管有时不同的C18柱可能是答案。但是希望这精神食粮是有益的!

直到下一次,

安妮

引用:

1. Giansanti, l . Tsiatsiani T.Y.低,A.J.R.见鬼。六个替代蛋白酶质量spectrometry-based胰蛋白酶之外的蛋白质组学。自然的协议,2016年。

关键词:生物柱液相色谱、提示和技巧,肽映射,反相,故障排除,AdvanceBio博客