疏水相互作用色谱的初学者指南

对反向相色谱法的咸味补充的简介，以添加到分析工具箱中

大家好！本周，关于我全新的主题的一系列博客文章开始了一系列博客文章。因此，我在与您一起学习时请一些同事做出贡献。我的研发团队的同事格雷格（Greg）将使我们入门。

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该博客系列将告诉您有关您可能不熟悉的色谱模式（我希望！）的所有内容：疏水互动色谱（HIC）。如果您从未在实验室中使用过HIC，那么您并不孤单。HIC不像其他分离方法那样常见，例如大小排除或反相（RP）。但是，HIC变得越来越流行，这证明了有关该主题的会议和文献演讲的数量。原因？日益复杂的蛋白质疗法继续将我们的分析技术投入测试，HIC是应对这些分离挑战的宝贵选择。

我一直很喜欢科学的历史，我喜欢通过调查其起源来学习关于陌生技术的学习。直到1973年[1]才出现“疏水相互作用色谱”一词，但这种分离模式的基础首次在1948年报告[2]。当时，众所周知，可以使用高浓度的盐来沉淀蛋白质。新的扭曲是，观察到的是，蛋白质在盐浓度下通常仅具有较弱的盐浓度亲和力，蛋白质强烈吸附到吸附剂上，远低于正常降水所需的盐浓度。HIC在色谱格式中的首次出现是在1962年，当时血清蛋白在交联的葡萄糖上分离[3]。用疏水功能取代的材料出现在1970年代初[4，5]，带有吸附剂提供的“纯”疏水相互作用（没有任何离子交换特性）出现在1973年[6]。

自首次描述以来，HIC已大大提高，并且通常用于大规模蛋白质纯化。在这种情况下，HIC可用于去除蛋白质聚集体和污染物，例如宿主细胞蛋白[7，8]。HIC还用于小规模的分析分离，这将是我们博客系列的重点。由于其独特的选择性，HIC与尺寸排除，离子交换和RP等技术互补。在这些技术中，HIC最像RP，因为分离与蛋白质疏水性密切相关。但是，HIC和RP之间存在两个关键差异：首先，HIC分离是由盐的降低而不是RP中的有机溶剂梯度升高的。其次，HIC分离保持蛋白质的天然状态，因此分离后蛋白质保持生物活性。例如，该活动允许收集纯化的峰进行下游效力测定。此外，蛋白质的天然状态意味着蛋白质表面的特征倾向于在HIC模式下驱动选择性。因此，HIC特别适合分离蛋白质的翻译后修饰或降解产物，这有时很难通过其他色谱模式来实现。

我们应该花一点时间解决盐的话题。HIC分离的初始条件以非常高的盐浓度开始，称为裂解盐。这些盐在其“盐分”蛋白质的能力方面是独一无二的，在Hofmeister系列中方便地总结了。HIC中最常用的溶作盐是硫酸铵，分离通常以1-2 m范围内的浓度开始。在整个梯度过程中，硫酸铵的浓度逐渐降低，并根据其相对疏水性分离蛋白质（疏水性越多，较晚的RT-因此，盐浓度较低，则需要较低的疏水性蛋白质）。在理解HIC分离机制方面已经有大量工作。如果您想阅读有关HIC蛋白质行为的一些调查的摘要，我将指出Lienqueo [9]的评论。

随着流动相的盐含量的降低，蛋白质以增加疏水性的顺序洗脱。

那么，最近如何将HIC用于生物制剂表征的一些示例呢？主要成功案例之一与抗体药物结合（ADC）表征有关[10]。在这种情况下，HIC可用于根据共轭小分子药物的数量来分离ADC，因此可用于计算药物与抗体比率或DAR [11]。还显示HIC可以将ASP/ISOASP异构体以及琥珀酰亚胺变体分离[12]以及蛋氨酸和色氨酸的氧化变体[13]。可以使用HIC分析双特异性mAB，这是一种越来越重要的方式，尤其是用于评估父母mAB的种群与预期的双特异性产品[14]。还可以评估蛋白质的相对疏水性作为聚集的潜在指标[10]。

蛋氨酸氧化和天冬酸异构化是HIC监测的两种翻译后修饰。

我希望此介绍可以让您了解HIC所提供的内容，并喜欢您喜欢这个博客系列。我认为，如果还没有，您会发现有很多理由将HIC添加到分析工具箱中。许多新的治疗方式的出现肯定会为这种强大的分离方式提供一些机会。

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大家好，安妮再次在这里。谢谢，格雷格！在接下来的几周中，我们将扩展Greg所谈到的一些主题 - 盐和流动相准备，ADC和其他蛋白质的方法开发以及一些最佳实践，以在使用高盐移动阶段时避免麻烦。直到下一次。

安妮

参考：

1. Hjerten，S.，疏水相互作用色谱的一些一般方面。J Chromatogr，1973年。87：p。325-331。
2. Tiselius，A.，通过腌制来吸附分离。Arkiv Foer Kemi，Mineralogi Och Geologi，1948年。26b：p。1-5。
3. Porath，J。，区域降水。大自然，1962年。196：p。47-48。
4. Yon，R.J。，含有混合疏水和离子基团的吸附剂上亲脂蛋白的色谱。Biochem J，1972年。126：p。765-767。
5. Er-El，Z.，Y。Zaidenzaig和S. Shaltiel，碳氢化合物涂层的sepharoses。用于纯化糖原磷酸化酶的纯化。Biochem Biophys Res Commun，1972年。49：p。383-390。
6. Porath，J。等人，在两亲性凝胶中盐盐，作为疏水吸附的新方法。大自然，1973年。245：p。465-466。
7. Jiang，C。等人，定义疏水相互作用色谱（HIC）纯化步骤的工艺设计空间：按设计（QBD）原理应用质量。Biotechnol Bioeng，2010年。107（6）：p。985-97。
8. McCue，J.T。等人，使用疏水相互作用色谱法建模蛋白质单体/骨料纯化和分离。BioProcess Biosyst Eng，2008年。31（3）：p。261-75。
9. Lienqueo，M.E。和A. Mahn，预测疏水相互作用色谱中的蛋白质保留时间。化学工程技术，2005年。28（11）：p。1326-1334。
10. Fekete，S。等人，疏水相互作用色谱，用于表征单克隆抗体和相关产物。J Pharm Biomed肛门，2016年。130：p。3-18。
11. Wakankar，A。等人，分析方法，用于抗体药物结合物的理化表征。mabs，2014年。3（2）：p。161-172。
12. Valliere-Douglass，J。，A。Wallace和A. Balland，通过微调疏水性相互作用色谱工作条件的微调，抗体变体的种群分离。J Chromatogr A，2008年。1214（1-2）：p。81-9。
13. 博伊德（D.），T。Kaschak和B. Yan，在互补性确定区域中，IgG1的HIC分辨率为氧化的TRP。J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011年。879（13-14）：p。955-60。
14. Zwolak，A。等人，通过选择性调节蛋白A结合来快速纯化人双特异性抗体。SCI REP，2017年。7（1）：p。15521。

关键词：生物柱，液相色谱，疏水互动色谱，HIC，AdvanceBio博客