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医生知道介绍一个咸补充反相色谱法添加到你的分析工具
大家好!本周开始一系列的博客主题的全新的我。因此我问我的一些同事做出贡献,而我和你学习。我的同事Greg从我们的研发团队会让我们开始。
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本系列博客会告诉你所有你需要知道的(我希望!)色谱模式,你可能不熟悉:疏水作用色谱(嗝)。如果您以前从未使用过实验室嗝,你并不孤独。嗝确实不常见的其他分离方法,如尺寸排除或反相(RP)。然而,嗝变得更受欢迎,越来越多的会议和文学的演讲。的原因吗?日益复杂的蛋白质疗法继续把我们的测试分析技术,嗝是一个有价值的选择,这些分离的挑战。
我一直喜欢科学的历史,我喜欢开始学习不熟悉的技术通过调查他们的起源。“疏水作用色谱法”这个词直到1973年才出现[1],但为这种分离模式在1948年首次报道[2]。当时,众所周知,蛋白质可以使用高浓度的盐沉淀。新的转折是观察到蛋白质吸附强烈的吸着剂通常只有懦弱的亲和力在盐浓度远低于通常需要沉淀。色谱格式嗝第一次出现是在1962年,当分离血清蛋白质交联葡聚糖[3]。与疏水材料替换功能出现在1970年代早期(4、5),吸着剂提供,“纯”疏水作用(没有任何离子交换属性)出现在1973年[6]。
嗝拥有先进的极大,因为它第一次被描述和通常用于大规模蛋白质纯化。在这种情况下,嗝是有用的对去除蛋白质总量和污染物如宿主细胞蛋白[7,8]。嗝也用于小规模的分析分离,这将是我们的博客系列的重点。由于其独特的选择性,嗝是互补技术像大小排斥、离子交换和RP。这些技术,嗝是最喜欢RP,分离与蛋白质疏水性密切相关。但有两个关键区别嗝和RP:首先,嗝分离是由梯度下降的盐,而不是越来越梯度的有机溶剂如RP。第二,嗝分色保持蛋白质的原生状态,因此蛋白质分离后仍具有生物活性。此活动允许下游纯化山峰的效力分析集合,例如。此外,本机状态的蛋白质意味着表面特性往往会推动选择性嗝模式。因此,嗝是特别适合于分离翻译修饰或蛋白质的降解产物,这是由其他色谱模式有时难以实现。
我们应该花一点时间解决盐的主题。初始条件为嗝分离开始非常高浓度的盐称为易溶的盐。这些盐的能力是独一无二的“盐”蛋白质,在他认为系列方便地总结。最常用的易溶的盐嗝硫酸铵,浓度和分离通常开始在1 - 2米范围内。硫酸铵的浓度逐渐减小的梯度,并根据它们的相对蛋白质分离疏水性(疏水越多,后来RT -因此低浓度的盐需要更多的疏水蛋白质)。有相当大的工作理解嗝分离的机理。如果你想阅读总结的一些蛋白质行为调查嗝,我点你来回顾Lienqueo [9]。
蛋白质洗提为了增加疏水性的流动相的盐含量减少。
那么一些近期的例子嗝是如何被用于生物制剂的特征?的一个主要的成功故事与抗体药物共轭(ADC)表征[10]。在这种情况下,嗝可用于单独的adc基于共轭小分子药物的数量,因此计算药物抗体比有用或DAR [11]。嗝也已被证明能够独立的Asp / IsoAsp同分异构体以及琥珀酰亚胺变异[12]和氧化变体蛋氨酸和色氨酸[13]。双特异性马伯,越来越重要的形态,可以使用嗝分析,特别是评估目的父母马伯的人口与双特异性产品[14]。相对疏水性蛋白也可以评估,作为一个潜在的指标聚合[10]。
蛋氨酸氧化和天冬氨酸异构化是两个转录后修饰监控的嗝。
我希望这个介绍给你一个嗝所提供的味道,你喜欢这个博客系列。我认为你会发现有很多理由分析工具箱添加嗝如果你没了。很多新的治疗方法的出现肯定会提供一些机会闪耀这强大的分离模式。
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嗨,安妮这里。谢谢,格雷格!在未来几周内我们将扩展的一些主题格雷格•感动——盐和流动相制备方法开发的adc和其他蛋白质,和一些最佳实践不惹是非,而使用高盐移动阶段。直到下次。
安妮
引用:
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- 钛氏、。通过盐析吸附分离。每年冬天,Mineralogi凯米市都会Arkiv福尔och Geologi, 1948年。26 b:1 - 5页。
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- 你,R.J。,包含混合吸附剂疏水亲脂性的蛋白质色谱和离子组。J, 1972。126年:765 - 767页。
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- Porath J。,et al.,盐析的两亲性凝胶作为一种新型的疏水性吸附方法。自然,1973年。245年:465 - 466页。
- 江,C。、等。定义流程设计空间的疏水作用色谱(嗝)净化步骤:应用程序质量的设计(QbD)原则。Biotechnol Bioeng, 2010年。107年(6):985 - 97页。
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- Lienqueo、a . Mahn预测蛋白质在疏水作用色谱保留时间。化学工程与技术,2005年。28(11):1326 - 1334页。
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- Valliere-Douglass, J。a·华莱士,a . Balland分离抗体种群变异的微调疏水作用色谱操作条件。J Chromatogr, 2008。1214年(1 - 2):81 - 9页。
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关键词:生物列、液相色谱、疏水作用色谱法,嗝,AdvanceBio博客