anne_blackwell
雷竞技raybet嗨了。任何分离实验的首要任务之一是流动相准备。所以这就是我的同事Sandeep带头来描述一些独特功能的疏水作用色谱流动相的准备。
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在最后一篇博文,格雷格介绍我们疏水作用色谱(嗝)及其需求增长作为描述单克隆抗体的分析工具(mAb)变异和抗体药物配合(adc)。我们还了解到,在色谱分离移动相包含盐析剂,在高浓度保留蛋白质通过增加蛋白质和固定相之间的疏水作用。这篇文章将集中在准备移动阶段和高盐缓冲嗝分离所需的条件。
盐是受雇于嗝增加或减少分析物绑定。盐的能力,促进疏水作用取决于离子种类及其浓度。基于他的系列图1所示,食盐(氯化钠)是相当效果低于硫酸铵((NH4) 2 so4)在蛋白质绑定色谱固定相。在实践中,氯化钠溶液需要大约四倍浓缩(NH4) 2 so4达到同样的效果。最常用的嗝是硫酸铵盐析剂,硫酸钠和醋酸铵。我们通常建议约1.5 - 2米硫酸铵作为起点。如果分析物的保留时间太长,开始流动相的盐浓度降低。
图1所示。Hofmesiter系列展示一些阴离子和阳离子蛋白质沉淀的影响
嗝分离中使用的高盐浓度可以发现在紫外线范围和观察基线漂移,如图2所示。LC级试剂和溶剂建议避免任何背景信号从试剂杂质。在嗝分色,重要的是收集一个空白梯度样品之前运行。基线漂移在示例可以最小化减去空白色谱来提高再现性。
图2。基线是观察到的差异取决于等级的硫酸铵
盐
类型的盐,盐的浓度在开始移动阶段,加入有机溶剂和pH值在嗝都是要考虑的重要参数。开始的盐浓度会影响决议如图3所示。在这种情况下,山峰早早洗提,与低盐浓度开始解决。更好的保留和分辨率观察当流动相盐浓度增加。
图3。盐浓度对色谱分离的影响
有机溶剂
添加有机溶剂可以提高分辨率特别是等大型疏水蛋白单克隆抗体和adc。最常用的有机溶剂异丙醇、乙腈。的影响增加流动相乙腈(ACN)与NIST马伯演示示例如图4 -改善峰形状和恢复。
图4。有机溶剂在色谱流动相的影响
流动相制备
为安捷伦Adva雷竞技raybetnceBio嗝列,使用这些条件作为起点,进一步调整开始盐浓度。
更少的疏水性样品:
流动相,2 M硫酸铵,50 - 100 mM磷酸钠,pH值7.0。
流动相B, 50 - 100 mM磷酸钠,pH值7.0。
adc等更多的疏水性样品:
流动相,1.5硫酸铵,50 mM磷酸钠,pH值7.0 /异丙醇(95:5 v / v)。
移动阶段B, 50 mM磷酸钠,pH值7.0 /异丙醇(80:20 v / v)。
硫酸铵在2 M容易溶解在几分钟内解决。工作时需要采取适当的预防措施与有机溶剂在高盐流动相,因为太多的有机溶剂会导致降水。为AdvanceBio嗝专栏中,我们建议使用有机溶剂异丙醇、乙腈(高达40%),确保没有列上的降水。总是使用0.22µm过滤器过滤移动阶段。(这是一个提醒发生什么不好的水流动相)做准备。
如此高的盐浓度会导致一些LC仪器的问题。因此建议您使用一个完全bio-inert LC,理想情况下与四元泵额外的通道可用于冲洗。它不是明智的离开嗝列或LC仪器2 M硫酸铵溶液中列,而不是冲进含有低浓度缓冲后使用的流动相。为更多的细节在方法开发和适当的列护理(包括长期存储),请参阅下列文件。
雷竞技raybet安捷伦AdvanceBio嗝列快速入门指南
雷竞技raybet安捷伦AdvanceBio嗝列用户指南
样品制备
确保适当的绑定示例,在开始流动相溶解样品。样本矩阵的影响在峰值形状是显示在图5中。当样品溶解在去离子水,早期的蛋白质洗脱峰(峰1和2)相比更广泛,面对观察样品溶解在0.5×流动相答:通常,样品直接溶解在高盐浓度流动相引起沉淀的蛋白质。因此,我们建议以下过程。如果是固体样品,样品溶解于水或适当的缓冲,然后开始流动相稀释样本两方面。如果你的样品已经在一个解决方案,只需与初始流动相稀释样品。确保样品不沉淀!
图5。样本矩阵的影响
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谢谢,Sandeep !在接下来的几周,我和我同事回来,安迪,他将带我们通过一些其他的方法参数嗝分析。一会儿聊！
安妮
关键词:生物列、液相色谱、疏水作用色谱法,嗝,LC流动相,AdvanceBio博客
