蛋白质和马伯的疏水作用色谱法

嗝分离蛋白质的方法开发技巧

既然Sandeep已经详细如何使这些咸移动阶段嗝,让我们把注意力转到其他方法开发的细节。这里是我的同事安迪会带头。

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蛋白质和马伯的疏水作用色谱法

疏水作用色谱(嗝)相当独特,它允许基于差异的分子分离疏水性,而他们在原生状态保持不变。这种独特的能力意味着它可以单独变体所难以解决的其他技术。例如,它可以单独变体在氧化态,脱酰氨基作用和其他物种产生翻译修饰。

最常用的流动相的嗝蛋白质使用高浓度的硫酸铵在稀磷酸缓冲。缓冲维护一个稳定的pH值,和硫酸铵确保蛋白质更容易吸附在色谱固定相,但不太可能沉淀。从高浓度的硫酸铵和执行到一个低浓度的梯度洗脱,确保分子洗提的顺序增加疏水性(几乎以相同的方式反相色谱,RPLC)。

水是很粘稠但添加修饰符如有机溶剂(RPLC)或高浓度的硫酸铵(嗝)可以进一步增加粘度。这个粘度增加将导致更高的操作压力和潜在的可怜的峰形状由于减少了传质。解决这个问题的最常用的工具是运行在更高的温度下高效液相色谱实验。

RPLC,更高的温度通常收到预期的效果:传质改善峰变得尖锐,操作压力降低。经常分子的保留时间也减少了,然而这种转变通常不会有问题的。

然而,在嗝,增加温度会产生有害的影响。而不是尖锐的峰值和保留时间短,我们经常看到增加保留时间和更广泛的山峰,导致损失的解决方法:

在实践中,获得更高的分辨率降低操作温度。值得注意的严重恶化在细胞色素C的峰形状甚至适度高温(40到45°C)在这个实验中使用。

更实际的应用,如氧化变异的单克隆抗体,可以使用氧化剂迫使降低样本用于方法开发。这种方法应该小心使用自氧化的程度将与氧化剂的选择,不同的浓度和接触时间的长度。一个典型的单克隆抗体可能包含16个人蛋氨酸残留分布在整个分子(包括重型和轻型链);这些残留物将位于更暴露的地区,因此反应更快。

重链和轻链的氨基酸序列NIST马伯(RM 8671)

中的蛋氨酸残留RM 8671 NIST马伯如图2所示,以粗体突出显示。那些红色的(Fc的重链和轻链的)被观察到氧化变体。

通过揭露NIST马伯样本tert-butylhydroperoxide (t-BHP),增加淋洗氧化变异被认为早些时候的数量:

氧化分析的更多信息,请参见安捷伦的应用程序雷竞技raybet5994 - 0199。

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谢谢你,安迪!下次安迪将扩大他的方法开发建议测量药物抗体的比例adc。

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